首先說(shuō)凍存液配方，常用的配方一般是兩種—— 90% FCS+10% DMSO 或 70% 培養(yǎng)基 + 20% FCS+10% DMSO。前一種較貴，而且后一種凍存效果也不錯(cuò)，因此本人一般選用第二種配方。對(duì)于比較脆弱的細(xì)胞則選用前一種凍存液。氣相液氮罐

凍存步驟比較簡(jiǎn)單，前期處理同細(xì)胞傳代，只是在離心后是直接吸取上清，用手拍打離心管底部，加入適量?jī)龃嬉菏辜?xì)胞完全懸浮后分裝于凍存管。制后先將凍存管放入4℃ 冰箱，約 40 min。 接著置于-20℃ 冰箱，約60 min。置于 -80℃ 超低溫冰箱中放置過(guò)夜。 最后置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。 同時(shí)做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。

注意事項(xiàng)

1. 使用 DMSO 前，不需要進(jìn)行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會(huì)破壞它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護(hù)效果。

2. 凍存時(shí)要選處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，這樣效果要好很多。

3. 不宜將凍存細(xì)胞放置在 0℃～-60℃ 這一溫度范圍內(nèi)過(guò)久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是「危險(xiǎn)溫區(qū)」。

4. 注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時(shí)添加。

5. 凍存液中的培養(yǎng)基要與培養(yǎng)時(shí)相同，避免細(xì)胞由于環(huán)境突然改變而死亡，在凍存管上也要標(biāo)明培養(yǎng)基種類。

6. 凍存液不要預(yù)熱。

7. 程序凍存盒非常好用，省事省時(shí)效果還好，強(qiáng)烈推薦凍存使用凍存盒。氣相液氮罐

細(xì)胞復(fù)蘇的原則是快速融化：必須將凍存在 -196℃ 液氮中的細(xì)胞快速融化至 37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

具體步驟

1. 將水浴鍋預(yù)熱至 40℃。

2. 用 75% 酒精擦拭紫外線照射 30 min 的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。

3. 在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。

4. 根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)。

5. 從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。

6. 迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。

7. 約 1-2 min 后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁。

8. 平衡后，放入離心機(jī)中 3000 r/min 離心 3 min。

9. 吸棄上清液。

10. 向凍存管內(nèi)加入1 ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。

11. 最后將細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃ 和 5% CO2 的培養(yǎng)箱內(nèi) 12-24 小時(shí)后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。

注意事項(xiàng)

復(fù)蘇時(shí)選用的培養(yǎng)基要符合凍存管上標(biāo)明的培養(yǎng)基。操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過(guò)程，此時(shí)蓋子易松掉。